現(xiàn)象：標(biāo)準(zhǔn)曲線正常，但所有植物樣品OD都很低，接近空白，算出來蛋白含量遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)預(yù)期。

1、研磨不充分（最常見）

原因：植物纖維多，液氮研磨沒磨成細(xì)粉末，組織還是小顆粒，蛋白釋放不wan全。

• ?錯(cuò)誤：只搗幾下，組織呈碎塊；液氮揮發(fā)完才研磨。

• ?解決：
1）樣品加液氮，充分磨成細(xì)膩白色粉末，看不到小組織碎片；
2）磨好后，在液氮還沒wan全揮發(fā)前快速加預(yù)冷提取液；
3）老葉、木質(zhì)化根要增加研磨時(shí)間；可以加少量石英砂助磨。

2、蛋白降解

原因：取樣、研磨、提取過程溫度太高，內(nèi)源蛋白酶水解蛋白。

• 風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)：室溫操作；研磨完回溫慢；離心溫度不是4℃；樣品放置很久才測(cè)。

• ?解決：
1）全部提取步驟冰上/4 ℃操作；
2）提取緩沖液可以加蛋白酶抑制劑PMSF（現(xiàn)加，終濃度1?mM）；
3）離心完上清盡快測(cè)，不要放室溫，暫存放?20℃；反復(fù)凍融要避免。
β?巰基乙醇主要抗氧化，不能抑制蛋白酶，只加它擋不住降解。
3、提取緩沖液pH不對(duì)

Bradford染料結(jié)合蛋白對(duì)pH敏感；植物蛋白大多中性偏酸，pH偏離7.0?7.4會(huì)降低提取效率、降低顯色。

• ?問題：PBS配錯(cuò)pH；緩沖液久放pH漂移。

• ?解決：
1）校準(zhǔn)pH計(jì)，提取緩沖液嚴(yán)格調(diào)到 pH 7.2左右；
2）不要用純水代替緩沖液提取，純水蛋白溶出很差。
注意：高濃度Tris也會(huì)干擾Bradford顯色，盡量用PBS體系。
4、樣品量太少

• 情況：取樣鮮重過小；或者提取液加太多，稀釋倍數(shù)過大。
舉例：0.1?g葉片，加5?mL提取液，蛋白被過度稀釋，OD壓到接近空白。

• ?調(diào)整：
葉片推薦：0.2?0.5 g鮮重 + 1?3 mL提取緩沖液（1:5 ~1:10 w/v）；
如果材料珍貴不能多加樣，減少提取液體積，提高蛋白終濃度。

額外容易忽略2個(gè)隱性原因（也會(huì)造成OD低）

1. PVP加太多：高濃度PVP會(huì)輕微干擾Bradford顯色，PVP?40建議1%即可，不要盲目加高。

2. 取樣部位問題：衰老葉片、木質(zhì)化老根本身可溶性蛋白本底就很低，不是操作問題，屬于材料本身。